了解RNA提取技術(shù)的前世今生，輕松搞定血液RNA樣本！

RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。RNA的提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，在進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建、體外反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Northern雜交分析等下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)都需要高質(zhì)量、高純度及完整性好的RNA。然而RNA很是“嬌弱"，一不小心就會(huì)提取失敗。究其原因主要是RNase的內(nèi)外源性污染。RNase是一種相對(duì)穩(wěn)定遍布我們生活的一種核酸內(nèi)切酶，比如我們的雙手、實(shí)驗(yàn)儀器、周圍環(huán)境，甚至樣品本身都有RNase的存在，它能催化RNA高效降解，因此能否有效防止RNase的污染，是提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵。

1. RNA簡(jiǎn)介

RNA是核糖核酸，其簡(jiǎn)稱來(lái)自于RiboNucleicAcid，是存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA是由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成的長(zhǎng)鏈狀分子。與DNA不同，RNA一般為單鏈長(zhǎng)分子，以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈，主要功能是實(shí)現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá)，是遺傳信息向表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中的橋梁。有些生物，例如一些病毒，也直接使用RNA作為遺傳信息的載體，如（SARS-CoV-2）。

2. RNA提取基本原理及原則

不同組織總RNA提取實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過(guò)不同方式去除多糖、酚類、蛋白以及DNA等雜質(zhì)，通過(guò)一系列的抽提、洗滌和沉淀，最終獲得高純RNA產(chǎn)物的過(guò)程。而RNA提取原則主要有4點(diǎn)：1. 保證RNA銷售結(jié)構(gòu)的完整性；2. 提取的RNA樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶存在抑制作用的有機(jī)溶劑及過(guò)高濃度的金屬離子；3. 其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到程度；4. 排除其它核酸分子（DNA）的污染。

3. RNA 提取技術(shù)的發(fā)展歷程

隨著RNA的深入研究和廣泛應(yīng)用，RNA提取純化技術(shù)也得到了很大的發(fā)展，從廣泛使用地傳統(tǒng)手工法RNA提取發(fā)展為通過(guò)核酸提取儀來(lái)自動(dòng)化提取RNA。

（1）傳統(tǒng)手工法RNA提取技術(shù)

早期的RNA提取技術(shù)

早期的RNA提取技術(shù)是異硫氰酸胍氯化銫超速離心法，其原理是使用蛋白質(zhì)變性劑異硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，經(jīng)過(guò)氯化銫介質(zhì)進(jìn)行密度梯度超速離心，使RNA沉淀于管底，但這種提取方法操作復(fù)雜、流程長(zhǎng)，一次提取的樣品數(shù)量有限并且對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高。后來(lái)為解決沒(méi)有超速離心等科研設(shè)備問(wèn)題，科學(xué)家們提出了鹽酸胍-有機(jī)溶劑法，利用胍鹽抑制RNA酶，勻漿裂解細(xì)胞，有機(jī)溶劑抽提去除蛋白質(zhì)，通過(guò)選擇性沉淀RNA分子而去除DNA，這種方法雖然解決了沒(méi)有超速離心機(jī)的問(wèn)題，但整個(gè)操作過(guò)程繁雜費(fèi)時(shí)。

Trizol法RNA提取技術(shù)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，又出現(xiàn)了很多手工提取純化RNA的技術(shù)，其中的是Trizol法。Trizol試劑的主要成分是苯酚和異硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能抑制RNA酶活性。異硫氰酸胍是強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)變性劑，既能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞消失而迅速與核酸分離，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層（無(wú)色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。Trizol試劑不但可用于小量樣品，也可用于大量樣品，對(duì)動(dòng)物、植物、細(xì)菌、血液提取都適用，可同時(shí)處理大量不同樣品。

柱提法和磁珠法RNA提取技術(shù)

Trizol法雖然被廣泛使用，得到的RNA的質(zhì)量也較好，但是Trizol試劑本身對(duì)身體有害。因此手工提取RNA法又陸續(xù)涌現(xiàn)了新的技術(shù)，如硅膠柱提法和手工磁珠法，其中柱提法試劑盒采用的裂解系統(tǒng)，無(wú)需有毒的酚/氯仿抽提，能在迅速裂解組織或細(xì)胞的同時(shí)抑制細(xì)胞釋放出的內(nèi)源RNase，保持RNA的完整性，通過(guò)吸附柱獲得RNA。手工磁珠法的原理是磁珠表面具有吸附作用的特定活性官能基團(tuán)可特異高效地吸附核酸。將細(xì)胞裂解后，加入磁珠對(duì)核酸進(jìn)行吸附，通過(guò)洗滌試劑純化去除雜質(zhì)獲得純凈的核酸。但手工法RNA提取技術(shù)始終存在著耗時(shí)、繁瑣、低效率等問(wèn)題。

（2）自動(dòng)化RNA提取技術(shù)

近年來(lái)分子診斷技術(shù)快速發(fā)展，實(shí)驗(yàn)的操作朝著更為簡(jiǎn)單和人性化的方向發(fā)展。分子診斷檢測(cè)的樣本類型多達(dá)數(shù)十種，而處理后RNA產(chǎn)物適用的檢測(cè)項(xiàng)目也涵蓋了熒光定量PCR、基因測(cè)序、基因芯片等各類分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)。然而，無(wú)論是哪一類檢測(cè)項(xiàng)目，準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)疑依賴于高質(zhì)量的標(biāo)本及標(biāo)本前處理過(guò)程。磁珠法RNA提取試劑加自動(dòng)核酸提取儀，就成為解決臨床分子診斷樣品前處理的組合。

4. 血液RNA樣本手工提取VS自動(dòng)提取

血液由血漿和血細(xì)胞兩部分組成，血液RNA主要存在白細(xì)胞中，紅細(xì)胞中有非常豐富的核糖核酸酶（RNase），會(huì)對(duì)RNA造成嚴(yán)重的降解，最大限度地降低RNase的影響是保證血液高質(zhì)量RNA提取的關(guān)鍵。與手工法提取相比，自動(dòng)化提取血液RNA操作更加簡(jiǎn)便、快速，可有效減少手工提取的操作失誤，同時(shí)的降低外源性RNase的污染，確保所提RNA產(chǎn)物的質(zhì)量和純度。

致善自動(dòng)化血液RNA提取系統(tǒng)

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